最新研究成果 RDS，可体外抑制新冠、非典及甲型流感病毒传染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋摘要

背景：以外正肆虐世界性的新型冠状病原病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个各地区和地区大流行起来，截至 2021 年 4 同年已导致大约 1.28 亿人传染，大约 280 数百人幸存者。近期，已为可必需提高 COVID-19 伤人率的疗法方法有。我们研究成果了一种宗教性的中所药口服本品——惟有肺毒口服液 (RDS) 的潜在外用冠状病原来时性，该口服液主要结合物为东方医学宗教性中所用于疗法肺结核病的中所药材。

结果：RDS 持续性 SARS-CoV 迟病原、SARS-CoV-2 迟病原、结合乙型肝炎病原-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 实为型病原以及传染性 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变型病原 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶亚基质的传染。我们全面证明了 RDS 可以从外部灭来时 SARS-CoV-2 病原致密的传染性。此外，我们发掘出 RDS 还可绕过乙型肝炎流感病原对靶亚基质的传染。

推论：RDS 可较广持续性消化道病原传染。关键字：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状病原，外用病原疗法，惟有肺毒口服液，宗教性中所药，SARS-CoV，乙型肝炎流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 实为型病原

▋背景

以外正肆虐世界性的新型冠状病原病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个各地区和地区大流行起来，截至 2021 年 4 同年已导致大约 1.28 亿人传染，大约 280 数百人幸存者。近期，已为可必需提高 COVID-19 伤人率的疗法方法有。新出现的 COVID-19 病原病原体为冠状病原 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在导致急性呼吸症就其冠状病原种类中所的同父病原[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中所国发掘出的；SARS-CoV 病原于 2002 年 11 同年在广东省首次被发掘出[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被发掘出[1,7,8]。在中所国，这两次由冠状病原引起的SARS中所，中所药原则上被较广用作，用以即时应对冠状病原引起的结核病。对于近期的 COVID-19 大流行起来，中所国有大约 85% 的 SARS-CoV-2 传染患者接受了宗教性中所医药疗法（9，10）。许多用作的中所药应该兼具必需的外用冠状病原结构上并在临床上应该必需，这个不可或缺缺陷未得到充份答复。

中所药作为疗法冠状病原所引发结核病的必需疗法，但由于缺乏体液或体外的系统研究成果，其发展与合理用作原则上受到了阻碍。为了明确中所药的潜在外用 SARS-CoV-2 来时性，我们从常用中所药中所筛选了多种药材所含物，并从中所药口服液 RDS(新泽西州一种商业化性药品补充剂) 中所发掘出了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 病原的来时性，一种在新泽西州的商业化药品补充剂。RDS 用于增强人体消化系统的相比之下有益，其包不含多种药材结合物，如人参和铁线莲，它们是宗教性上用于高度集中炎症和肺结核病的中所药材 (11-13)。在此，我们刊文 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 实为病原以及兼具传染性的野生型 SARS-CoV-2 病原对靶亚基质的传染兼具持续性作用。我们全面证明 RDS 可通过从外部灭来时病原致密或制止病原进犯而持续性病原的中期传染进度。此外，我们发掘出 RDS 还可以制止甲流病原对靶亚基质的传染。这些相比之下，RDS 对消化道病原的传染可能兼具较广的持续性作用。

▋结果

为了从宗教性中所药材中所不见到潜在的外用 SARS-CoV-2 来时性，我们从约四十种宗教性药材中所筛选所含出 SARS-CoV-2S 亚基实为型迟病原[14,15] 和人体肺 A549(ACE2) 靶亚基质，此生命体 ACE2 基因不必要通过迟病原转导作为多肽介导，从而保持稳定转导来充份利用超隐含。迟实为型病原用作绿色激光亚基 (GFP) 或激光素在酶 (Luc) 作为刊文基因，并通过了兼具广谱外用病原转回持续性剂，以及贝拉索勒 (Arbidol)[16]，和生命体外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(布 1a、C) 的必需性。我们并能取得成功结合物到贝拉索勒 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 实为型病原的持续性作用，这是我们在其他四十余种宗教性药材所含物测试者中所未发掘出的，还包括其中所一些发挥作用较高神经毒素在的药材 (布 1a-C)。然而，鉴于迟性实为型病原非常少能结合物 SARS-CoV-2 病原的进犯不当，我们不能排除这些药材所含物可能有在转回后之前并能持续性 SARS-CoV-2 的可能性。我们全面从宗教性口服惟有肺毒口服液 (RDS) 中所筛选出了可能的外用 SARS-CoV-2 来时性，该电子产品不内含九种药材结合物——、人参、人参、铁线莲、天名精、苦杏仁、蜂房、皂角、生姜，在中所国宗教性上用于疗法肺结核病 (11-13)。

不内含吡啶果汁碱、3，4-二邻果汁甲酰奎宁碱、吡啶 3，4-二邻果汁甲酰奎宁碱、原儿茶碱、吡啶绿原碱和青藤草素在；花蕾中所还不内含反转录 A、B 和 10 种值得注意环烯醚异戊二烯反转录[17]；该药用植物还不内含皂甙甙 A 和 B，以及外用炎症作用的反转录 C[18,19]。人参酯反转录中所不内含木脂素在、松脂醇和人参反转录[20]。人参中所不内含被称为人参皂反转录的甾体皂反转录，是人参原属药用植物独特的药用植物有机派生物[21,22]。小果铁线莲中所主要来时性结合物为四种单异戊二烯，(−)-蜂蜜吡啶、(+)-普莱格吡啶、(−)-柠檬烯和 (+)-蜂蜜甲苯；这种药用植物还不内含其他派生物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛吡啶、β-同年桂烯和β-石竹烯[23]。天名精不内含大约 162 种派生物，还包括环烯醚异戊二烯和环烯醚异戊二烯反转录、苯丙反转录、水溶性、酚、糖类、黄吡啶类、和皂反转录[24]。苦杏仁中所不内含酚类、芳基派生物和果胶蛋白酶[25]。皂角刺中所不内含皂反转录和羽扇豆碱[26,27]，而生姜中所不内含主要来时性结合物生姜碱[28]。为了全面测试者 RDS 的外用 SARS-CoV-2 来时性，用多种不同一定量剂量的 RDS 预解决缺陷 A549(ACE2) 亚基质，然后让这些亚基质在发挥作用 RDS 的情况接受 4-6 同一时间段的传染。传染后，在不发挥作用 RDS 的情况培植亚基质，然后在 48 和 72 同一时间段的时候，通过流结构设计亚基质妖术对病原传染的持续性作用开展加权。为了高度集中亚基质神经毒素在，用作钴丙啶 (PI) 对即将幸存者和已幸存者的亚基质开展上色，非常少在来时亚基质群中所数据分析 GFP+亚基质。如布 2 标明，我们注意到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 实为病原兼具mg持续性持续性作用。为了得出结论这些结果，我们用作不可逆隐含 ACE2 的 VeroE6 亚基质减法了该传染飞行测试中。

(不见下页布)

ACE2 内部隐含，而今 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 病原可对其开展传染，ACE2 通常用于冠状病原的研究成果 (7)。尽量避免在缺乏 ACE2 超隐含 [15，29，30] 的情况，实为型病原对 VeroE6 的传染性较高，我们还用作了激光素在酶刊文基因实为型病原，该病原的刊文基因隐含由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，兼具更高的刊文基因敏感性和信噪比。

布 2：RDS 持续性 SARS-CoV-2(GFP) 实为型病原传染 A549(ACE2) 亚基质。

A.A549(ACE2) 亚基质用 RDS 年中一定量 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 实为型病原传染。将亚基质浴去病原和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的情况开展培植。流结构设计亚基质仪结合物病原传染持续性情况。未传染的亚基质和传染 SARS-CoV-2(GFP) 但不予 RDS 疗法的亚基质作为相符合。GFP+亚基质总和已揭示。(PI) 钴丙啶。

B.RDS 的亚基质神经毒素在分析方法。A549(ACE2) 亚基质用 RDS 年中一定量 4 同一时间段，浴去 RDS，无 RDS 培植 48 同一时间段。钴丙啶上色鉴定正在幸存者亚基质和已幸存者亚基质，流结构设计亚基质妖术数据分析。绘图mg-底物亚基质神经毒素在椭圆，RDS 的半伤人剂量 (LC50) 比率为 1:11.9。

如布 3A 标明，我们用作 Luc 份文件基因实为病原和 VeroE6 亚基质开展传染飞行测试中，注意到到 RDS 对该病原传染兼具mg持续性持续性作用，并且半数持续性剂量明确为 1:230RDS 一定量度 (布 3B)。我们还加权了 RDS 对 VeroE6 亚基质来时力的影响，明确了 50% 亚基质幸存者mg为 1:11.8RDS 一定量度。

布 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 实为病原和野生型 SARS-CoV-2 病原的mg持续性持续性持续性作用。用 RDS 年中一定量预解决缺陷 A、BVeroE6 亚基质，他用 SARS-CoV-2(Luc) 实为型病原传染。将亚基质浴去病原和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的情况开展培植。在传染后 72 同一时间段用激光素在酶结合物病原传染的持续性作用。未传染亚基质和 SARS-CoV-2-luc 传染但不予过 RDS 疗法的亚基质作为相符合。飞行测试中减法三次。绘图mg底物椭圆和 RDS 的 I-C50 一定量比率为 1:230。CRDS 对 VeroE6 亚基质的亚基质神经毒素在也通过钴丙啶上色和流结构设计亚基质妖术分析方法。用 RDS 年中一定量 4 同一时间段，浴去 RDS，在不不含 RDS 的情况培植 72 同一时间段。绘图亚基质神经毒素在mg-底物椭圆，RDS 的半伤人剂量 (LC50) 比率为 1:13.8 一定量。DRDS 持续性传染性 SARS-CoV-2 传染。用年中一定量的 RDS 预解决缺陷 VeroE6 亚基质，并在 RDS 发挥作用的情况传染 SARS-CoV-2。传染 48 同一时间段后，通过异种菌斑数据分析病原释放后的病原镜像持续性情况。持续性飞行测试一结构设计四份开展，并在 Prism7(Graph Pad) 中所用作单向方差 (One-Way ANOVA) 数据分析及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，意在明确统计显着性。明显性值用下标回应如下：*p

为了全面必需性用作实为病原获得的结果，我们测试者了 RDS 对于 SARS-CoV-2 传染的绕过传染性能力。如布 3D 标明，RDS 同时也绕过了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 亚基质的传染。RDS 在一定量 1:40 以上时可明显下降病原白斑的形成。

综上，通过 SARS-CoV-2 实为病原与传染性病原的相比之下，RDS 不内含持续性 SARS-CoV-2 传染的来时性结合物，可能是通过从外部灭来时病原或绕过病原的中期传染进度。

为全面研究成果可能的机制，我们将传染性 SARS-CoV-2 病原致密与年中一定量的 RDS 在 37°C 下预培植 1 同一时间段。随后，将结合物全面分作一定量-(10–1 至 10–4)，并转入 Vero 亚基质开展异种菌斑数据分析以明确病原传染性的提高。如布 4A 标明，我们注意到到在 RDS 中所短暂沾染一同一时间段后的病原致密，其 SARS-CoV-2 的传染效价也方形mg持续性下降。该结果得出结论了 RDS 可必需从外部灭来时 SARS-CoV-2 病原致密的传染性。

我们全面测试者了 RDS 应该也能持续性 SARS-CoV-2 病原变型的传染。为此，我们运用都只开发的结合甲病原-SARS-CoV-2 实为型病原 (Ha-CoV-2)[31] 来化学合成一系列 S 亚基类似于，还包括法国类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，巴西类似于 (P.1)，加州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和就其 S 亚基相异体在 37°C 年中一定量 RDS 培植 1 同一时间段。随后，用该结合物传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶亚基质。传染后 12 同一时间段，激光素在酶量度病原传染的持续性作用。如布 4B 标明，我们还注意到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 亚基类似于的mg持续性持续性。

我们还测试者了 RDS 绕过 SARS-CoV 传染的能力，用作含有 SARS-CoV 突刺亚基的 GFP 刊文基因迟病原和[15] 非常少非常少只是mg。我们将人 A549(ACE2) 亚基质用作靶亚基质，将其用系列一定量的 RDS 预解决缺陷，然后用 SARS-CoV(GFP) 份文件基因实为病原传染 4-6 同一时间段。传染后在不不含 RDS 的情况培植亚基质，流结构设计亚基质妖术加权结合物其对病原传染的持续性作用。同样，用作钴丙啶排除正在幸存者与已幸存者的亚基质，非常少在来时亚基质群中所数据分析 GFP+亚基质。如布 5A 标明，我们注意到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 实为型病原的持续性作用方形mg持续性。我们全面得出结论了这些结果，并加权了 RDS 介导的持续性与 Luc 刊文基因 SARS-CoV 实为型病原，SARSCoV(Luc)。我们注意到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的持续性作用方形mg性依赖，其半持续性剂量 (IC50) 为 1:70.88 一定量度 (布 5B，C)。尽量避免 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用作 ACE2 传染靶亚基质，我们还测试者了 RDS 的外用病原来时性应该非常少针对与 ACE2 有交互作用的冠状病原。为此，我们结合物了一种不就其的负链 RNA 病原--乙型肝炎流感病原。它通过病原血凝素在 (HA) 和亚基质α-唾液碱来传染靶亚基质。为了化学合成乙型肝炎流感病原，将隐含乙型肝炎流感 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个多肽和一个 GFP-刊文基因共转染到 HEK293T 亚基质中所。在 RDS 发挥作用的情况，采集病原致密他用于传染远距离 MDCK 亚基质。如布 6A 标明，我们注意到到 RDS 对乙型肝炎流感病原的持续性作用方形mg持续性。RDS 在 1:40 和 1:80 一定量时可非常少非常少绕过病原传染，在 1:160 一定量亦同可一小持续性乙型肝炎流感。RDS 对 MDCK 亚基质的半伤人剂量 (LC50) 经量度为 1:18.5(布 6B)。这些相比之下，RDS 的外用病原来时性并非针对特定病原，而可能并能较广持续性多种消化道病原，如冠状病原和乙型肝炎流感病原。

▋讨论

在本份文件中所，我们证明了宗教性口服惟有肺毒口服液 (RDS) 不内含广谱外用病原来时性，可绕过 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型肝炎流感病原的传染。虽然 RDS 并能持续性多种病原，但其外用病原来时性因病原子类和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 迟实为病原的 I-C50 剂量为 1:7.9 一定量度，对 SARS-CoV-2 迟实为病原的 I-C50 剂量为 1:230 一定量度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 病原，I-C50 为 1:40 一定量度，对乙型肝炎流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变型有多种不同的持续性作用，IC50 系数从 1:70 到 1:2601 一定量度不等 (布 4B)。

(不见下一页布)

布 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和派生的 Ha-CoV-2 变型兼具mg持续性灭来时作用。ASARS-CoV-2 致密加年中一定量的 RDS 在 37°C 下培植 1 同一时间段。随后，将结合物全面年中一定量，并转入 Vero 亚基质中所开展异种菌斑数据分析，以明确病原传染性提高。持续性飞行测试一结构设计四份开展，并在 Prism7(GraphPad) 中所用作单向方差 (One-WayANOVA) 数据分析和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 意在明确统计显着性。明显性值用下标回应如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和就其 S 亚基类似于与年中一定量的 RDS 在 37°C 培植 1 同一时间段后，用结合物传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶亚基质。传染后 12 同一时间段，激光素在酶量度病原传染的持续性作用。RDS 的 IC50 值的一定量度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们全面证明了 RDS 可以持续性冠状病原的中期传染进度。虽然具体的外用病原机制未清楚，但 RDS 可以通过从外部灭来时病原致密或通过制止病原进犯或绕过病原进犯后的中期进度来制止病原传染。在其他几种宗教性中所药中所也发掘出了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的来时性。例如，一种常不见的宗教性中所药——生姜。

生姜根中所已证明不内含生姜碱素在，可持续性 SARS 病原[32] 临床分离株的镜像。此外，另一种可用于疗法消化道结核病的中所药——双黄连本品，已揭示出在体外以mg持续性方法持续性 SARS-CoV-23CL 亚基酶 (3CLpro) 来时性。铁线莲反转录和铁线莲素在拟作为双黄连绕过 3CLpro[33] 的苯甲碱。

布 5 RDS 持续性 SARS-CoV 实为型病原对 A549(ACE2) 亚基质的传染。用年中一定量的 RDS 预解决缺陷 A、B 亚基质，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 实为型病原传染。将亚基质清浴，去掉病原和 RDS，在不发挥作用 RDS 的情况开展培植。在传染后 48 同一时间段和 72 同一时间段，通过流结构设计亚基质妖术或激光素在酶结合物来分析方法病原传染的持续性作用。飞行测试中减法三次。绘图mg声势浩大椭圆，并绘图 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 一定量度 (C)

布 6 RDS 持续性甲流病原对 MDCK 亚基质的传染。(A) 用年中一定量的 RDS 预解决缺陷 MDCK 亚基质 30 分钟，然后用甲流病原 (GFP) 对其开展传染。传染后，在 RDS 发挥作用下培植亚基质。36 同一时间段后用流结构设计亚基质仪对病原传染的持续性作用开展分析方法。把未传染的亚基质与被甲流病原 (GFP) 传染但不予 RDS 解决缺陷的亚基质开展对比。布中所揭示了 GFP+亚基质的总和。PI 回应钴丙啶 PI。

(B) 另外还用作了 MTT 量度法分析方法了 RDS 对 MDCK 亚基质的神经毒素在，绘图了亚基质神经毒素在的mg-底物椭圆，经计算，RDS 的半数伤人剂量为 1:18.5 一定量度 RDS 的必需外用病原结合物未明确。然而，RDS 多种不同于铁线莲反转录和铁线莲素在，RDS 可以通过从外部灭来时病原原子核来绕过病原传染 (布 4)，而铁线莲反转录和铁线莲素在则在病原生命周期的后期通过绕过病原亚基酶的来时性来发挥作用。然而，RDS 的体外外用 SARS-CoV-2 来时性仍才可在今后的鸟类研究成果和生命体临床飞行测试中所得到得出结论。以外，我们正在开展小型鸟类飞行测试中，以明确 RDS 在体液绕过 SARS-CoV-2 病原传染的潜力。

▋推论

我们的研究成果表明，RDS 可较广持续性消化道病原的传染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型肝炎流感。

▋方法有

亚基质和亚基质培植

HEK293T (ATCC 卡萨维斯，爱德华亚州) MDCK (ATCC 卡萨维斯，爱德华亚州)，VeroE6 (ATCC 卡萨维斯，爱德华亚州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨维斯，爱德华亚州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨维斯，爱德华亚州) 以外存留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific) 不内含 10% 冷灭来时 FBS 和 1×派生物-吲哚在 (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 亚基质培植基中所分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的剂量转入嘌呤霉素在和潮霉素在 B。

遗传物质转染和病原化学合成

不含 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的迟性实为型病原致密由 Virongy LLC (Manassas，VA) 提供者，或按照下面详细描述的方法有[15] 化学合成。简言之，为了化学合成 GFP 刊文基因迟性实为病原，HEK293T 亚基质与隐含 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产出激光素在酶刊文基因迟性实为型病原，将 HEK293T 亚基质与隐含 SARSCoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 开展共转染。转染后 48 同一时间段采集病原上清液，离心浓缩，−80℃ 存留。野生型 SARS-CoV-2 病原 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 提供者。pHW-NAGFP (ΔAT6) 份文件基因遗传物质和 A/WSN/1933 H1N1 派生遗传物质 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 助手友好提供者。在流感病原 A-GFP 刊文基因原子核化学合成中所，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 亚基质 (ΔAT6)。48 同一时间段后采集病原上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 隐含多肽购自 Sinobiological。运用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多肽和 S 亚基相异多肽。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基相异原子核按照下面详细描述方法有[31] 开展化学合成。

病原传染和口服持续性飞行测试

RDS(惟有肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，爱德华亚州) 是由马助手飞行测试中室 (Burnaby，BC，Canada) 生产线的一种商业化电子产品。RDS 中所所有中所药材结合物原则上符合《中所国原产地 2015 年版》「饮片」标准，还包括苯甲碱不含量及重金原属、农药附送结合物。RDS 是一种中所药的共煎剂，就此产物在真空先决条件下冷却。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 护士提供者。将贝拉朵尔乙酯 (Sigma) 原先悬浮在二吡啶亚砜 (Sigma) 中所。对于实为型病原传染，12 孔板中所的 A549(ACE2) 亚基质 (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨维斯，爱德华亚州) 或 VeroE6 亚基质用 RDS 预解决缺陷 30 分钟，在 37℃ 下传染 4-6 同一时间段，然后在新鲜培植基中所浴涤培植 48-72 同一时间段。对于 VeroE6 亚基质的传染，亚基质也被 CoV-2 实为型病原传染增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，卡萨维斯，爱德华亚州) 预解决缺陷后，在 37°C 下再行解决缺陷 30 分钟。用作 GloMaxDiscover 酶标仪 (Promega) 数据分析亚基质裂解物的激光素在酶来时性。对于野生型 SARS-CoV-2 传染，VeroE6 亚基质在 37°C 下用 RDS 预解决缺陷 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 传染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华沃克医学院的 BSL-3 救助服务设施内停留 1 同一时间段。亚基质用 PBS 浴涤 2 次，用不含 RDS 的培植基培植 48 同一时间段。从上清中所所含病原，用 12 孔板培植的 Vero 亚基质单层中所的异种菌斑飞行测试量度小瓶滴度。简言之，每个结合物在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培植基 (VWR) 中所化学合成，包不含 1X 派生物-吲哚在 (VWR)，并添加 10% 的 FBS(赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一定量液孔洞到 VeroE6 亚基质单层的三个平行孔上 1 同一时间段。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一一小完整的 Eagle Minimal Essential 培植基 (VWR) 的结合物伸展单层，不含 1X 派生物-吲哚在，并添加 10%FBS。48 同一时间段后，将单层管壁固定在 10% 甲醛水溶液中所 1 同一时间段，并去除伸展的琼脂里斯。为了上色白斑，转入不内含 20% 乙醇的 1% 结晶紫颜料水溶液 5 分钟，然后用去离子水浴涤。对于乙型肝炎流感病原传染 MDCK 亚基质，在 37°C 下用 RDS 预解决缺陷 30 分钟，然后用 A-GFP 刊文基因病原传染 6 同一时间段。用不含 RDS 的培植基浴涤亚基质，培植 36 同一时间段。GFP 隐含通过流结构设计亚基质仪分析方法。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 病原致密的 RDS 灭来时飞行测试，将 100μl 年中一定量的 RDS 添加到 1 mlSARS-CoV-2 病原原液 (3.65×105PFU/ml) 中所，就此 RDS 一定量为 1:20，1:40 或 1:80。也还包括相符合先决条件 (1 ml 病原+100μl 培植基)。结合物在 37°C 下培植 1 同一时间段。随后，对结合物开展系列一定量以转化成额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一定量度，并将年中一定量的结合物转入 12 孔板中所的 Vero 亚基质中所，用于开展异种菌斑量度数据分析。白斑量度中所就此的 RDS 一定量度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一定量液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基相异原子核按照下面详细描述的方法有[31] 化学合成。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭来时，将 5μl 年中一定量的 RDS 添加到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于中所，就此 RDS 一定量度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将结合物在 37°C 下培植 1 同一时间段，然后在 RDS 发挥作用下传染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 亚基质 12 同一时间段。用作 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 数据分析亚基质裂解物的激光素在酶来时性。

亚基质神经毒素在数据分析结合物

用钴丙啶上色和流结构设计亚基质妖术加权对 A549 (ACE2) 亚基质和 VeroE6 亚基质的口服亚基质神经毒素在开展结合物，如所述 (34)。用作亚基质增殖醛盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 亚基质的口服神经毒素在开展加权。简言之，将 MDCK 亚基质 (ATCC) 以每孔 1×-105 个亚基质的加速哺育到 12 孔板中所。亚基质培植隔夜后，通过 RDS 解决缺陷 1 天，然后在 MTT 标记醛 (Sigma) 的培植基中所培植。将亚基质与标记醛共同培植 4 同一时间段，再行后续转入 MTT 增水溶液。培植皿一窝过夜，用 GloMax Discover 酶标仪 (Promega) 量度吸视星等。

缩写

SARS-CoV：导致急性消化系统青光眼就其冠状病原；SARSCoV-2：Severe 导致急性消化系统青光眼就其冠状病原-2；TCM：宗教性中所药；RDS：消化道排毒口服液；Ha-CoV-2：结合乙型肝炎新冠病原实为病原。

致谢

感谢 FengLi 提供者流感病原隐含多肽，感谢 LanceLiotta 提供者外用毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与敦促；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 提供者 RDS 和药材所含物。

所写贡献

此次飞行测试中由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 外观设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该飞行测试中。所有所写已学习者并批准就此稿件。

资金

本研究成果的费用来自于爱德华沃克医学院内部拨出 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该捐款由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 提供者。

数据和涂层的可用性

本研究成果中所转化成或数据分析的所有数据原则上包不含在本文中所。醛可从 Y.W 处利用。

声明

批准及参与同意

不一般而言

同意出版

不一般而言

竞争利益

爱德华沃克医学院各地区微生物牵制和传染病中所心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究成果大力支持，LAH 为德佳和畅担任顾问并获得了酬金。未其他关系或来时动可能不必要影响到提交的指导工作。

所写详细信息

1新泽西州爱德华亚州爱德华沃克医学院系统微生物学学院各地区微生物牵制和传染病中所心，卡萨维斯 20110。

2VirongyLLC，爱德华亚州卡萨维斯。3澳大利亚伯纳比，BCV5J0E5 马助手飞行测试中室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 新泽西州爱德华亚州利斯堡世界卫生科学组织，20176。

收稿月份：2021 年 4 同年 7 日

接受月份：2021 年 5 同年 10 日

线上出版时间段：2021 年 5 同年 29 日

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